脂肪酸合成酶(FAS)檢測(cè)試劑盒/分光光度法注 意:正式測(cè)定之選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶,催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中,在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。
FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和NADP+;NADPH在340nm有吸收峰,而NADP+沒(méi)有;通過(guò)測(cè)定340nm 光吸收下降速率,計(jì)算FAS活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體50mL×1瓶,-20℃保存。用1 d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二:粉劑×1瓶。臨用加入1100 μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用加入1100 μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四:液體50mL×1瓶, 4℃保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用加入2100μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
粗酶液提。
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。12000g,4℃離心40min,取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3,間隔7,總時(shí)間3min);然后12000g,4℃,離心40min,取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體:直接測(cè)定。
脂肪酸合成酶(FAS)檢測(cè)試劑盒/分光光度法
FAS測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 測(cè)定管:在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、20μL試劑二、20μL試劑三、820μL試劑四和40μL試劑五,迅速混勻后于340nm處測(cè)定吸光值,記錄第30s和90s時(shí)吸光值,分別記錄為A1和A2!鰽測(cè)=A1-A2。
FAS活性計(jì)算公式:
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T=1608×△A÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1608×△A ÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T=1608×△A
ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,1000μL=0.001 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,100μL=0.1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。
關(guān)鍵詞:
脂肪酸合成酶(FAS)檢測(cè)試劑盒 脂肪酸合成酶(FAS)試劑盒 脂肪酸合成酶(FAS)測(cè)試盒