豬偽狂犬病病毒野毒株實時熒光PCR法檢測試劑盒

參數(shù)規(guī)格
英文名稱：s Detection Kit (Real-Time PCR Method)
規(guī)格：50T/盒
【預(yù)期用途】豬偽狂犬病病毒野毒株實時熒光PCR法檢測試劑盒利用Taq-man實時熒光PCR原理，定性篩查檢測炭疽桿菌，對疾病診斷、醫(yī)治療效及醫(yī)院環(huán)境評估有重要指導(dǎo)意義
【檢驗原理】 豬偽狂犬病毒抗體檢測試劑盒系由預(yù)包被豬偽狂犬病毒重組gD蛋白的酶標板、酶標記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測豬血清、血漿樣本中豬偽狂犬病毒抗體。實驗時在酶標板中加入對照血清和待檢樣本，經(jīng)溫育后若樣品中含有豬偽狂犬病毒抗體，則將與酶標板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的其他成分后；再加入酶標記物，與酶標板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標記物，在孔中加TMB底物液，與酶反應(yīng)形成藍色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標儀在450nm波長測定各反應(yīng)孔中的吸光值，即可知樣品是否含有豬偽狂犬病毒抗體。偽狂犬病毒（Pseudorabies disease virus，PRV）可引起豬偽狂犬病，導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)死胎、種豬不育、仔豬發(fā)病死亡等綜合癥候群。豬偽狂犬病毒抗體檢測試劑盒用于檢測豬血清、血漿中豬偽狂犬病毒抗體，可用于豬偽狂犬病毒疫苗免疫效果評價。

配件
豬豬偽狂犬病病毒野毒株實時熒光PCR法檢測試劑盒的組成

2. 標本采集，方法如下：注：陰性對照為基因組DNA，陽性對照為失去活性的病毒cDNA。
儲存方式
避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
標本要求
1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

 (1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中，密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物：無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。

3.應(yīng)避免標本間交叉污染。

4.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】豬偽狂犬病病毒野毒株實時熒光PCR法檢測試劑盒

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

操作流程

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

適用范圍【參考值】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

測試報告【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】豬偽狂犬病病毒野毒株實時熒光PCR法檢測試劑盒的最低檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

操作流程

1. 整個檢測過程應(yīng)嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。

3. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記。

7. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。

上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細胞學(xué)等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風(fēng)生物”、“彩佑實業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽”的精神，堅持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽為國內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。

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